一、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與神經(jīng)干細(xì)胞
神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起始于胚胎早期的神經(jīng)管和神經(jīng)嵴，其中央管在發(fā)育的終末形成腦室系統(tǒng)和脊髓的中央管，管腔內(nèi)面被覆的細(xì)胞為神經(jīng)上皮(neuroepithelium)，具有活躍的增殖和分化能力，在胚胎早期此區(qū)域稱為腦室／腦室下區(qū)(ventricular/subventricular zone，VZ／SVZ)，而在成年后則稱為室管膜／室管膜下區(qū)(ependymal/subepen-dymal zone，EZ／SEZ)，在神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)過程中起著舉足輕重的作用。
有關(guān)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的起源，長期以來一直存在著爭議，目前被大多數(shù)神經(jīng)生物學(xué)家接受的是“一元論”的發(fā)生機(jī)制，即神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞來源于共同的干細(xì)胞。這種干細(xì)胞由胚胎早期室管膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生并具有多向分化的潛能，因此被稱為多潛能神經(jīng)干細(xì)胞(multipotential neural stem cell)，迄今為止，多潛能干細(xì)胞的概念仍不十分確切，因此命名也尚未統(tǒng)一，有的學(xué)者也稱之為前體細(xì)胞(precursor cell)或祖細(xì)胞(progenitor cell)，總之，代表具有下述特性的一類細(xì)胞：(1)可自我復(fù)制或更新(self-renew)，產(chǎn)生與自己相同的子代細(xì)胞，維持穩(wěn)定的細(xì)胞儲備；(2)處于較原始的未分化狀態(tài)，無相應(yīng)成熟細(xì)胞的特異性標(biāo)志；(3)具有多向分化的潛能，即演變成不同成熟細(xì)胞類型的能力。
Lendahl等通過實(shí)驗證明中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多潛能干細(xì)胞或前體細(xì)胞在胞漿內(nèi)表達(dá)一種被稱為巢蛋白或巢素(nestin)特異性蛋白，現(xiàn)已證實(shí)其屬于中間絲(intermediate filament)蛋白家族，只在多潛能的神經(jīng)外胚層細(xì)胞表達(dá)，隨著神經(jīng)上皮的分化成熟逐漸消失，其功能現(xiàn)在尚未*明確，可能與其它家族成員相似，同時具有結(jié)構(gòu)和信息傳遞的功能；通過檢測巢蛋白的表達(dá)即可確定多潛能干細(xì)胞的存在。另外，利用分子水平的細(xì)胞譜系追蹤技術(shù)，通過腦室內(nèi)注射表達(dá)熒光蛋白或b-半乳糖苷酶(LacZ)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SVZ區(qū)處于分裂期的細(xì)胞，可以對干細(xì)胞的增殖、移行和分化過程進(jìn)行監(jiān)視。通過上述方法，目前已經(jīng)證實(shí)在成年哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)至少有兩個區(qū)域存在著具有增殖能力的細(xì)胞，即室下區(qū)和海馬結(jié)構(gòu)齒狀回的顆粒細(xì)胞層下區(qū)(subgranular zone，SGZ)。這兩個區(qū)域原始細(xì)胞的表型目前還不清楚。
二、神經(jīng)干細(xì)胞的研究方法
1.體外研究 常規(guī)分離神e799bee5baa6e58685e5aeb931333233656561經(jīng)干細(xì)胞的方法是在活體動物腦內(nèi)已經(jīng)確定有細(xì)胞分裂的部位切取部分組織，在含有高濃度的致有絲分裂原的培養(yǎng)基中孵育，經(jīng)過增殖后，誘導(dǎo)細(xì)胞向不同的子代細(xì)胞分化。分化的鑒定通過在單細(xì)胞形成子代克隆中，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測神經(jīng)元、星形細(xì)胞、及少突膠質(zhì)細(xì)胞所表達(dá)的特異性抗原。
定義一組體外培養(yǎng)的細(xì)胞為多潛能干細(xì)胞也存在著許多問題，其中重要的是必須證明這些細(xì)胞具有向不同成熟細(xì)胞分化的能力。雖然現(xiàn)在*可以應(yīng)用特異性抗體標(biāo)記神經(jīng)元、星形細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞，但是神經(jīng)元的種類有數(shù)百種，若證明真正意義上的“多潛能”尚有很多的工作要做。
目前國外一些研究機(jī)構(gòu)相繼報道了建立干細(xì)胞系的工作，與原代培養(yǎng)相比，為體外觀察和移植研究提供了較穩(wěn)定的材料；但是應(yīng)用病毒或v-myc等癌基因修飾的“永生化細(xì)胞”遺傳特性改變并有繼續(xù)突變的趨勢，可能在移植后生成腫瘤或在分析正?；?qū)ψ哟?xì)胞分化方向時產(chǎn)生影響，因而其應(yīng)用價值有待于進(jìn)一步評價。
2.在體研究 神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的研究主要通過追蹤干細(xì)胞分裂、分化后產(chǎn)生的細(xì)胞譜系構(gòu)圖(lineage
mapping)進(jìn)而了解細(xì)胞發(fā)育間的“親緣”關(guān)系。通常認(rèn)為細(xì)胞發(fā)育是由其祖先和環(huán)境因素共同決定，即受細(xì)胞內(nèi)外調(diào)節(jié)因素的共同調(diào)控。為進(jìn)一步確定經(jīng)體外培養(yǎng)鑒定的干細(xì)胞的分化潛能，將擴(kuò)增后／或經(jīng)基因修飾的干細(xì)胞移植到腦內(nèi)進(jìn)行觀察，結(jié)果證明植入的細(xì)胞不僅可以在發(fā)育期腦和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛移行，而且向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化，甚至人胚胎來源的干細(xì)胞在植入成年大鼠腦內(nèi)也可以分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞；同時發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞分化方向似乎由其所處的局部環(huán)境而非內(nèi)在的特性決定，胚胎來源的干細(xì)胞沿著宿主細(xì)胞移行并分化成為移植部位的特殊細(xì)胞類型，植入的細(xì)胞在正常發(fā)育的腦內(nèi)對局部信號的適宜反應(yīng)導(dǎo)致了這種“嵌合”現(xiàn)象，使其與宿主細(xì)胞很難區(qū)別。Rosario等將培養(yǎng)的干細(xì)胞植入基因突變致小腦前葉發(fā)育缺如的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞逐漸分化成顆粒細(xì)胞并形成小腦的內(nèi)顆粒層；電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示供體細(xì)胞分化而來的顆粒細(xì)胞與宿主苔蘚纖維建立了突觸聯(lián)系。上述這種顯著的可塑性并不局限在發(fā)育期腦內(nèi)，從成年動物海馬來源的干細(xì)胞也可以在植入海馬后分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，與齒狀回正常分化的細(xì)胞類型相似；更進(jìn)一步，這些細(xì)胞在植入RMS(rostral migratory
stream)后還可以分化為嗅球神經(jīng)元并具有合成酪氨酸羥化酶的能力，這種酶在正常海馬細(xì)胞內(nèi)是不能合成的；而在移植到成年動物正常情況下不產(chǎn)生神經(jīng)元的部位，干細(xì)胞則不能生成神經(jīng)元而是向膠質(zhì)細(xì)胞分化。令人驚訝的是Bjornson等報道從胚胎或成年小鼠腦內(nèi)取得的細(xì)胞經(jīng)標(biāo)記后移植到放射損傷的宿主鼠體內(nèi)，竟然分化為骨髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其它原始的造血細(xì)胞，其結(jié)果提示神經(jīng)干細(xì)胞的分化潛能不只局限于神經(jīng)系統(tǒng)。在受損傷的發(fā)育期腦內(nèi)，干細(xì)胞則向損傷部位移行并替代缺失的細(xì)胞。由此推測，植入的細(xì)胞在分裂增殖的同時，可能“辨別”其所處的環(huán)境，但是什么因素始動分化并決定其分化方向還有待于進(jìn)一步探索，其中必然交雜著內(nèi)外因素的復(fù)雜作用，供體細(xì)胞本身所具有的內(nèi)在分化程序、局部環(huán)境中的神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、黏附分子及細(xì)胞間的相互作用均可能參與其中。
3.影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的因子 在多細(xì)胞有機(jī)體內(nèi)，每一個細(xì)胞的活動均受到極其復(fù)雜的內(nèi)、外環(huán)境信號之間相互作用的調(diào)控，其中生長因子可能是涉及此過程中的主要信號分子。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的各種因子對發(fā)育期細(xì)胞的存活、增殖、移行和分化，成年時期功能的維持，損傷時細(xì)胞的可塑性改變，都有著非常重要的影響。其中研究中應(yīng)用多的生長因子是EGF和bFGF，已知EGF是星形膠質(zhì)細(xì)胞的致有絲分裂原，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中也可以促進(jìn)神經(jīng)存活和突起生長，Weiss等證明其對培養(yǎng)的干細(xì)胞有明顯的刺激增殖作用，其子代細(xì)胞可向神經(jīng)元、星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。bFGF據(jù)報道也具有相同的作用，而且在低濃度下尚有誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的作用。當(dāng)EGF和bFGF注射入成年鼠腦室內(nèi)，EGF可強(qiáng)烈刺激SVZ細(xì)胞增殖，對SGZ的細(xì)胞則無作用；bFGF的作用相對較弱；但是新生鼠通過注射bFGF則可導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)目增多。已經(jīng)檢測具有相類似作用的還有神經(jīng)生長因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等，但是它們的作用機(jī)制仍不清楚。
三、神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用前景
1.細(xì)胞移植 以往腦內(nèi)移植或神經(jīng)組織移植研究進(jìn)展緩慢，主要受到胚胎腦組織的來源、數(shù)量以及社會法律和倫理等方面的限制。神經(jīng)干細(xì)胞的存在、分離和培養(yǎng)成功，尤其是神經(jīng)干細(xì)胞系的建立可以無限地提供神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，解決了胎腦移植數(shù)量不足的問題，同時避免了倫理學(xué)方面的爭論，為損傷后進(jìn)行替代治療提供了充足的材料。研究表明，干細(xì)胞不僅有很強(qiáng)的增殖能力，而且尚有潛在的遷移能力，這一點(diǎn)為治療腦內(nèi)因代謝障礙而引起的廣泛細(xì)胞受損提供了理論依據(jù)，借助于它們的遷移能力，可以避免多點(diǎn)移植帶來的附加損傷。另外，神經(jīng)干細(xì)胞移植也為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及可塑性的實(shí)驗研究提供了觀察手段，前文提及細(xì)胞因子參與調(diào)控神經(jīng)元增殖和分化，通過移植的手段對這些因素的具體作用形式和機(jī)制進(jìn)行探索，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
2.基因治療 目前誘導(dǎo)干細(xì)胞向具有合成某些特異性遞質(zhì)能力的神經(jīng)元分化尚未找到成熟的方法，利用基因工程修飾體外培養(yǎng)的干細(xì)胞是這一領(lǐng)域的又一重大進(jìn)展；另外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)發(fā)育期甚至成熟神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性和結(jié)構(gòu)的完整性，將編碼這些遞質(zhì)或因子的基因?qū)敫杉?xì)胞，移植后可以在局部表達(dá)，同時達(dá)到細(xì)胞替代和基因治療的作用。
3.自體干細(xì)胞分化誘導(dǎo) 移植免疫至今為止仍是器官或組織移植的首要問題。前文提到已經(jīng)證明成年動物或人腦內(nèi)、脊髓內(nèi)存在著具有多向分化潛能的干細(xì)胞，那么使人們很容易想到通過自體干細(xì)胞誘導(dǎo)來完成損傷的修復(fù)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，首先反應(yīng)的是膠質(zhì)細(xì)胞，在某些因子的作用下快速分裂增殖，形成膠質(zhì)瘢。其實(shí)在這個過程中也有干細(xì)胞的參與，可不幸的是大多數(shù)干細(xì)胞增殖后分化為膠質(zhì)細(xì)胞，什么機(jī)制控制著細(xì)胞的分化決定，確切機(jī)制尚未明了。一旦這個機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，無疑對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)來講是一個重大的飛躍，因為它不僅可以避免移植造成的不必要損傷，更重要的是可以避免排斥反應(yīng)。體外實(shí)驗已經(jīng)證明某些因素的誘導(dǎo)分化作用，但是應(yīng)用到臨床尚有一段距離，可我們?nèi)詮那笆龀晒Φ奶剿髦锌吹较Ｍ⑾嘈旁谶@方面的突破即將到來。