小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞是肺微循環(huán)的核心功能單元，參與氣體交換、炎癥調(diào)控及血管屏障維持。分離培養(yǎng)高純度PMVECs是研究肺血管生理病理機(jī)制的關(guān)鍵技術(shù)，以下為常用方法概述。
一、細(xì)胞分離
1.材料準(zhǔn)備：選取6-8周齡健康C57BL/6小鼠，麻醉后無(wú)菌取肺組織；消化試劑含0.1%Ⅱ型膠原酶、0.01%DNA酶Ⅰ及0.25%胰蛋白酶，37℃預(yù)溫。
2.組織解離：肺組織剪碎后經(jīng)膠原酶消化30min，機(jī)械吹打至單細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min去碎片；紅細(xì)胞裂解液處理5min去除紅細(xì)胞，PBS重懸后過(guò)40μm濾網(wǎng)。
3.內(nèi)皮細(xì)胞富集：利用內(nèi)皮細(xì)胞特異性貼壁特性，將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基預(yù)包被的培養(yǎng)皿，37℃、5%CO?孵育1-2h，未貼壁的成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)經(jīng)換液去除，貼壁細(xì)胞即為初步富集的PMVECs。
二、原代培養(yǎng)
貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后傳代，采用含20%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素及1ng/mLVEGF的EGM-2MV專用培養(yǎng)基，每2-3天換液一次。細(xì)胞呈鋪路石樣生長(zhǎng)，融合達(dá)80%-90%時(shí)可傳代，一般可傳3-5代保持表型穩(wěn)定。
三、細(xì)胞鑒定
1.形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞為多邊形或鵝卵石樣，邊界清晰，單層融合時(shí)無(wú)明顯重疊。
2.免疫熒光標(biāo)記：固定細(xì)胞后，用抗CD31（PECAM-1）、vWF（血管性血友病因子）或VE-cadherin（鈣黏蛋白）一抗孵育，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗顯色，熒光顯微鏡下可見(jiàn)胞膜或胞質(zhì)特異性陽(yáng)性信號(hào)。
3.功能驗(yàn)證：DiI-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)（37℃孵育2h后胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光顆粒）；管腔形成實(shí)驗(yàn)（Matrigel基質(zhì)上形成網(wǎng)狀管樣結(jié)構(gòu)）。
注意事項(xiàng)
分離過(guò)程需嚴(yán)格無(wú)菌操作，控制消化時(shí)間與溫度以避免細(xì)胞損傷；鑒定時(shí)需設(shè)置同型IgG陰性對(duì)照，排除非特異性染色。該方法可獲得純度＞90%的PMVECs，適用于肺血管屏障、炎癥及纖維化等研究。
更新時(shí)間：2025-12-11
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